Jhonnatha Oliveira – Doutorando UFRRJ
Paula Cardoso – Doutoranda UFRRJ
Prof Dr Julio Cesar F Jacob – UFRRJ
Introdução
O uso da transferência de embriões (TE) e o desenvolvimento desta em equinos tiveram um aumento considerável nas duas últimas décadas. O Brasil ocupa lugar de destaque no emprego desta técnica juntamente com os Estados Unidos e Argentina, sendo um dos líderes mundiais em TE realizadas por ano. A raça Mangalarga Marchadaor, hoje no Brasil, é a que mais faz uso desta técnica. Embora a TE esteja consolidada no Brasil, fatores relacionados a idade como distúrbios ovulatórios, desenvolvimento inicial do embrião no oviduto e migração do embrião até o útero não conseguem ser sanados pela TE. Neste sentido outra biotécnica da reprodução, a transferência de oócitos, tem sido utilizada de forma comercial no exterior, possibilitando a utilização de éguas com os problemas descritos acima num programa comercial de produção de embriões equinos.
Transferência de Embrião em Equinos (TE)
Esta biotécnica tem sido utilizada para a produção de múltiplos potros por égua ao ano, e melhor aproveitamento de éguas que possuam alto valor zootécnico ou que estejam em atividade esportiva (HURTGEN, 2008; ARRUDA et al., 2001; DAELS, 2007). É capaz de gerar potros de éguas subférteis por problemas adquiridos, as quais ficam impedidas de exercer uma gestação devido a razões como idade, infecção uterina crônica, danos cervicais e alterações adquiridas do trato reprodutivo. Razões incomuns para o uso da TE e preservar a égua da gestação podem incluir a laminite crônica, severa artrite, cólicas não resolvidas ou perigosos problemas comportamentais da fêmea para os tratadores, outros cavalos e ao potro da mesma (HURTGEN, 2008).
A coleta do embrião normalmente se faz pelo uso de um cateter tipo Foley inserido através da cérvix, sendo inflado um cuff com ar. O cateter é recuado contra o óstio interno da cérvix, e um a dois litros de meio é infundido ao útero. Este fluido é então drenado do útero da égua doadora passando através de um copo com filtro que retém o embrião (Figura 1). O embrião é então, identificado e qualificado. Embora embriões possam ser recuperados nos dias 6 a 9, o período ideal para sua colheita é nos dias 7 ou 8 após a fertilização (SQUIRES & SEIDEL, 1995).
Figura 1: Procedimento de coleta do embrião.
a) Sonda Foley com cuff inflado acoplado a solução de Ringer com lactato para infusão uterina; b) Sonda já posicionada no útero e drenagem do lavado contendo o embrião através do filtro coletor; c) observação do embrião com 8 dias de idade ao olho nu; b) avaliação do embrião sob microscopia. Fonte: (JACOB, 2009)
A TE em equinos é comumente realizada de forma não cirúrgica por via cervical, associada a avaliação e seleção da égua receptora (FLEURY et al., 2007). Esta técnica é muito menos invasiva, rápida e de alto percentual de prenhez, na qual consiste em depositar o embrião recuperado da doadora no corpo do útero da receptora com o uso de uma pipeta de inseminação que atravessa a cérvix (LIRA et al., 2009) (Figura 2 ).
Figura 2: Procedimento transferência não cirúrgica do embrião, utilizando-se pipeta para Inseminação Artificial para equinos, ultrapassando-se vulva, vagina cérvix e depositando o embrião no corpo do útero. Fonte: JACOB, (2009)
Fatores ligados a idade do embrião (dia da colheita), tamanho do embrião, idade do corpo lúteo da receptora, bem como o método de transferência, interferem nos índices de prenhez (FLEURY et al., 2001). Deve-se respeitar o grau de sincronia entre a ovulação da receptora e doadora, traduzido pela idade do corpo lúteo da receptora (IMEL et al., 1981), que pode variar de -1, 0, +1, +2, +3, +4 e +5, (JACOB et al., 2010), onde -1 equivale a ovulação da receptora um dia antes da doadora e +5 cinco dias após doadora. Nas ultimas décadas, houve um grande avanço desta biotécnica melhorando consideravelmente as taxas de prenhez de 12,5% a 74.55% (Vogelsang et al., 1979; Rocha., et al., 2004).
Em um programa de TE as taxas de prenhez e de perda embrionária são influenciadas por uma variabilidade de fatores como o método de transferência, o técnico, o tamanho, a idade e a morfologia do embrião, a nutrição, a sincronização entre doadoras e receptoras, os procedimentos de cultivo e armazenagem de embriões, a idade e história reprodutiva de doadoras e receptoras de embriões, o método e intervalo de detecção da prenhez e o clima (JASKO, 2002; LOSINNO e ALVARENGA, 2006; SQUIRES et al., 2003; JACOB et al., 2010; McKINNON et al., 1988; BALL, 1993).
Aspiração Folicular e Transferência de Oócito
Embora a transferência de embriões, tenha se tornado importante ferramenta para obter produtos de éguas incapazes de manter gestação (CARNEVALE et al., 2001a), a TE exige que a égua seja capaz de ovular um oócito saudável, transportá-lo do folículo até o oviduto, transportar o embrião do oviduto até o útero, além de proporcionar um ambiente uterino adequado ao desenvolvimento embrionário. Caso apresente falha em algum destes mecanismos, as éguas podem ainda produzir descendentes através do uso de outras técnicas de reprodução assistida, como a transferência de oócitos que de pende da aspiração folicular (COUTINHO DA SILVA, 2008).
A aspiração folicular, é um método não-invasivo que vem apresentando sucesso para obtenção de oócitos (CARNEVALE, 2004).
As indicações para realização desta técnica incluem falha na ovulação e na captação do oócito, patologias severas de oviduto, útero e/ou cérvix, abrangendo infecções uterinas crônicas, lacerações cervicais ou fibrose do útero ou oviduto (COUTINHO DA SILVA, 2008).
A incidência de falhas na ovulação aumenta de acordo com a idade da égua (CARNEVALE et al., 1994). Estudos sugerem que a redução na fertilidade ocorre antes do embrião entrar no útero, especialmente em éguas velhas pois a ovulação não ocorre ou oócito não alcança o oviduto (Carnevale et al. 2001a; CARNEVALE, 2007).
Além da captação e transporte do oócito, o oviduto exerce função na seleção e manutenção do espermatozóide. No oviduto de éguas subférteis, poucos espermatozóides apresentam motilidade, enquanto em éguas férteis, são encontrados espermatozóides com elevada motilidade (Scott et al. 1995).
As causas uterinas de redução de fertilidade são frequentemente diagnosticada na égua. Alterações inflamatórias ou infecciosas são prejudiciais a viabilidade do espermatozóide e ao embrião. Muitas éguas não têm causa de infertilidade diagnosticada, mas após diversas tentativas, não se obtém embrião (CARNEVALE, 2007). A OPU pode ser utilizada para estas éguas visando a obtenção de oócito saudável para posterior fertilização in vitro ou in vivo.
A aspiração transvaginal guiada por ultrassom é a técnica mais utilizada atualmente (CARNAVELE, 2004) a qual utiliza-se da ultrassonografia para visualizar e guiar o procedimento de penetração e aspiração do folículo, podendo o aparelho estar acoplado ao transdutor linear, setorial ou convexo. Após alojar o transdutor em um estojo contendo um guia para a agulha, este é posicionado no interior da vagina, lateral a cérvix e ipsilateral ao ovário contendo o folículo pré-ovulatório. Por meio da palpação transretal, o ovário é fixando contra o transdutor e o guia da agulha. A agulha (12 gauge) é então avançada até que a parede vaginal seja ultrapassada e o folículo puncionado. O fluido folicular contendo o oócito é aspirado utilizando-se de uma bomba de sucção (CARNEVALE, 2004).
Figura 3: a) Aparelho de ultrassonografia com transdutor acoplado ao estojo contendo a guia e a agulha para aspiração folicular. b) superfície convexa do transdutor e agulha de aspiração. Fonte: (? Curso TE Júlio)
Pode-se promover a estimulação ovariana para aumentar o número de folículos pré-ovulatórios (PURCELL et al., 2007). Para tanto a técnica mais utilizada é a administração exógena do extrato de pituitária eqüina (EPE) (McCUE, 1996; WELCH et al., 2006; Sá et al., 2010).
Para acelerar a maturação folicular e oocitária, faz-se a utilização de gonadotrofinas como hCG (Gonadotrofina Coriônica humana) ou acetato de deslorelina (análogo de GnRH – Hormônio Liberador de Gonadotrofina) (CARNEVALE et al., 2004).
Os oócitos podem ser aspirados 24 a 35 horas após a administração das gonadotrofinas e cultivados in vitro para completar a maturação (CARNEVALE et al., 2004). Os oócitos coletados aproximadamente 36 horas após a administração de hCG provavelmente estão maduros e aptos a fertilização, podendo ser imediatamente transferidos (CARNEVALE e MACLELLAN, 2006) (Figura 4).
Figura 4: oóctos equinos obtidos por aspiração folicular.Fonte: DELL’AQUILA et al. (1999)
Na transferência de oócito, o oócito da égua doadora é colocado no oviduto de uma égua receptora que será inseminada pelo útero ou o e spermatozóide pode ser colocado junto do oócito, dentro do oviduto, e então a técnica será chamada transferência intrafalopiana de gametas (GIFT). Para ambas técnicas o embrião e o feto se desenvolverá no útero da receptora, assim como na transferência de embriões (CARNEVALE, 2004).
Embora possa-se utilizar receptoras acíclicas, o oócito coletado da doadora será transferido para uma receptora cíclica cuja ovulação foi sincronizada a da doadora como na TE, esta receptora terá o seu folículo pré-ovulatório aspirado para remoção do seu oócito de modo que o oócito fertilizado seja o da doadora (Carnevale, 2004). Esta transferência é realizada de forma cirúrgica através de laparotomia, realizando-se uma incisão no flanco (SQUIRES & SEIDEL, 1995), em seguida do peritônio, e então o ovário e o oviduto são localizados e gentilmente exteriorizados. O oócito previamente obtido da doadora será então gentilmente transferido para dentro oviduto da receptora sendo transportado em meio de manutenção em uma pipeta de vidro através do óstio infundibular. (CARNEVALE et al., 2004) (figura 5). Imediatamente ou em até 12 horas após a transferência a receptora será inseminada com sêmen do garanhão desejado (CARNEVALE et al., 2004).
Figura 5: Transferência cirúrgica do oócito através do óstio infundibular. Fonte: SAMPER, (2007)
O diagnóstico de gestação é então realizado aos 15 ou 16 dias de vida do embrião
A taxa de gestação após a transferência do oócito pode variar de 27 a 40% quando utilizados doadoras idosas e sêmen de qualidade variável (CARNEVALE et al., 2001b), entretanto quando usa-se éguas jovens e semên de alta qualidade a taxa de gestação varia de 53 a 83% (CARNEVALE et al., 2001c).
Referencias bibliográfica
ARRUDA R.P., VISINTIN J.A., FLEURY J.J., GARCIA A.R., MADUREIRA E.H., CELEGHINI E.C.C.; NEVES NETO J.R. Existem relações entre tamanho e morfoecogenicidade do corpo lúteo detectados pelo ultra-som e os teores de progesterona plasmática em receptoras de embrião eqüinos? Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., 38:233-239, 2001.
BALL, B.A. Embrionic death in mares. In: McKINNON, A.O., VOSS, J.L. (Ed.) Equine reproduction. Malvern: Lea & Febiger, 517-531, 1993.
Carnevale, E.M.; Bergfelt, D.R.; Ginther, O.J. Follicular activity and concentrations of FSH and LH associated with senescence in mares. Animal Reproduction Science, Amsterdam, v. 35, p. 231 – 246, 1994.
CARNEVALE, E. M.; SQUIRES, E. L.; MACLELLAN, L.J.; ALVAERNGA, M.A.; THOMAS, J.S. Use of oocyte transfer in a commercial breeding program for mares with reproductive abnormalities. Journal of the American Veterinary Medical Association, Schaumburg, USA, v. 218, n. 1, 2001a.
CARNEVALE, E. M.; MACLELLAN, L.J.; COUTINHO DA SILVA, M. A.; CHECURA, C. M.; SCOGGIN, C. F.; SQUIRES, E. L. Equine sperm-oocyte interaction: results after intraoviductal and intrauterine inseminations of recipients for oocyte transfer. Animal Reproduction Science, Amsterdam, v. 68, p. 305–314, 2001b.
CARNEVALE, E. M. Oocyte transfer and gamete intrafallopian transfer in the mare. Animal Reproduction Science, Amsterdam, v. 82–83, p. 617–624, 2004.
CARNEVALE, E. M. Collection and Transfer of Oocyte in Mares. In: Samper, J.C.; Pycock, J.F.; McKinnon, A.O. Current Therapy in Equine Reproduction. St Louis, Missouri: Saunders Elsevier, seção VI, 492 p., 2007.
Coutinho da Silva, M. A. When should a mare go for assisted reproduction? Theriogenology, Stoneham, Mass., USA, v. 70, p. 441 – 444, 2008.
DAELS P. Embryo transfer tips and trics. Proceedings 5th European Veterinary Conference, Voorjaarsdagen, Amsterdam, 213-215, 2007.
FLEURY, J.J.; PINTO, A.J. ; ARQUES, A.; LIMA, C.G.; ARRUDA, R.P. Fatores que afetam a recuperação embrionária e os índices de prenhez após ransferência transcervical em eqüinos da raça Mangalarga. Braz. J. vet. Res. anim. Sci., 38(1): 29-33, 2001
FLEURY P.D.C., ALONSO M.A., SOUSA F.A.C., ANDRADE A.F.C. & ARRUDA R.P. Uso da gonadotrofina coriônica humana (hCG) visando melhorar as características reprodutivas e fertilidade de receptoras de embriões eqüinos. Rev. Bras. Reprod. Anim., 31:27-31, 2007.
HURTGEN J.P. Management of embryo donor mares with chronic infertility. Proceedings 54th Annual Convention of the American Association of Equine Practitioners, San Diego, California, 414-417, 2008.
JACOB, J.C.F.; SANTOS, G.O.; OLIVEIRA, J.P.; GASTAL, M.O.; GASTAL, E.L. Evaluation of reproductive parameters in a comermercial equine embryo transfer program, Animal Reproduction Science, 12: 305-306, 2010.
JASKO, D.J. Comparison of pregnancy rates following nonsurgical transfer of day 8 equine embryos using various transfer devices. Theriogenology, 58: 713-715, 2002.
LIRA, R.A.; PEIXOTO, G.C.X.; SILVA, A.R. Transferência de Embrião em Equinos: Revisão. Acta Veterinaria Brasilica, 3(4):132-140, 2009.
LOSINNO, L.; ALVARENGA, M.A. Critical factors on equine embryos transfer programs in Brazil and Argentina. Acta Scientiae Veterinariae, 34:39-49, 2006
MCKINNON, A.O.; SQUIRES, E.L.; CARNEVALE, E.M. Ovariectomized steroid-treated mares as embryo transfer recipients and as a model to study the role of progestins in pregnancy maintenance. Theriogenology, 29:1055-1063, 1988.
OGURI, N.; TSUTSUMI, Y. Non-surgical recovery of equine eggs, and attempt at non-surgical egg transfer in horses. Journal of Reproduction and Fertility, 31(2): 187-195, 1980.
ROCHA FILHO A.N., PESSÔA M.A., GIOSO M.M.; ALVARENGA M.A. Transfer embryos into anovulatory recipients supplement with short or long acting progesterone. Animal Reprod. 1:91-95, 2004.
Scott, M.A.; Liu, I.K.M.; Overstreet, J.W. Sperm transport to the oviduct: abnormalities and their clinical implications. In: Annual Convention of the American Association of Equine Practitioners, 41th, 1995, Lexington, Proceedings… Lexington, A.A.E.P., 1995, p. 1-2.
SQUIRES E.L.; SEIDEL G.E. Collection and transfer of equine embryos. Animal Reproduction Biotechnology Laboratory Bulletin. Colorado State University, Fort Collins, 397, 1995.
VOGELSANG S.G., SORENSEN A.M., POTTER G.D., BURNS S.J.; KRAEMER D.C. Fertility of donor mares following nonsurgical collection of embryos. J. Reprod. Fertil. 27:383-386, 1979.
